Các xét nghiệm đối với hội chứng hô hấp cấp tính nặng coronavirus 2 (SARS-CoV-2) gồm phương pháp phát hiện sự hiện diện của virus và phương pháp phát hiện các kháng thể do cơ thể sinh ra để đáp ứng với nhiễm virus.

Xét nghiệm phân tử: phản ứng chuỗi polymerase sao chép ngược thời gian thực (rRT-PCR), có khả năng phát hiện RNA của SARS-CoV-2, có thể được thực hiện trên các mẫu từ đường hô hấp, gồm các mẫu tăm bông mũi hoặc đờm. Xét nghiệm này giúp phát hiện RNA của SARS-CoV-2 và được sử dụng để xác nhận nhiễm virus gần đây hoặc đang hoạt động.

Xét nghiệm kháng thể (huyết thanh học) có thể được sử dụng cả cho chẩn đoán và giám sát cộng đồng dân cư. Một phần của phản ứng miễn dịch của cơ thể đối với nhiễm virus là sự tổng hợp các kháng thể IgM và IgG. Các kháng thể IgM đối với SARS-CoV-2 thường có thể phát hiện được trong máu vài ngày sau khi bị nhiễm lần đầu. Kháng thể IgG đối với SARS-CoV-2 có thể được phát hiện muộn hơn sau nhiễm virus. Xét nghiệm kháng thể cho biết có bao nhiêu người đã mắc bệnh, bao gồm cả những người có triệu chứng nhẹ hoặc không có triệu chứng.

Hiện có hai loại xét nghiệm có thể phát hiện xem một người đã bị nhiễm SARS-CoV-2 và có vi-rút COVID-19 hay không. Hai loại xét nghiệm đó là:

Xét nghiệm nhằm phát hiện sự hiện diện của virus SARS-CoV-2 trong cơ thể bệnh nhân, được thực hiện bằng cách kiểm tra xem có virus có trong dịch tiết của mũi, nước bọt hoặc đờm.

Xét nghiệm phát hiện xem cơ thể bệnh nhân có tạo ra các kháng thể chống lại SARS-CoV-2 hay không. Điều này thường được thực hiện bằng cách lấy một mẫu máu để tìm các kháng thể IgM và IgG chống lại COVID-19.

1. Cấu trúc bộ gen và quá trình nhân lên của SARS-COV-2

1.1. Cấu trúc bộ gen của SARS-COV-2

Tương tự như các coronavirus khác, bộ gen RNA là một sợi dương của SARS-COV-2 chứa ít nhất 6 khung đọc mở (open reading frame: ORF) tương ứng với các protein dự đoán khả năng gây bệnh của các virus, bao gồm:

- Protein enzym RNA polymerase phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA polymerase, RdRP),

- Glycoprotein dăm S (spike),

- Protein vỏ virus E (envelope),

- Protein màng M (membrane),

- Nucleoprotein bao nhân N (nucleocapsid)

- Các protein phụ khác mà virus sử dụng để lây nhiễm các tế bào

Hình 1: Vùng 5 ′ UTR và 3 ′ UTR và vùng mã hóa của COVID-19, SARS-CoV và MERS-CoV. Sự khác nhau trong cách sắp xếp các gen tương ứng với các protein E, M và N của các virus COVID-19, SARS-CoV và MERS -CoV được thể hiện ở đầu 3′ tận cùng (Mousavizadeh L and Ghasemi S, 2020).

1.2. Chu kỳ sống của SARS-CoV-2

Chu kỳ sống (life cycle) của SARS-CoV-2 trong tế bào phổi của người gồm 6 giai đoạn:

1- Spike protein trên bề mặt virus gắn vào ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2) là một protein bề mặt tế bào (Wu KJ, 2020) và TMPRSS2 (transmembrane serine protease2) là một enzym giúp virus xâm nhập vào tế bào;

2- Virus giải phóng ra RNA của nó;

3- Một số RNA được phiên mã thành các protein nhờ bộ máy sinh tổng hợp protein của tế bào;

4- Một số các protein này tạo thành một phức hợp giúp virus sao chép ra nhiều bộ gen RNA của nó;

5- Các protein và RNA hình thành một virus mới trong bộ Golgi của tế bào và

6- Virus được phóng thích ra khỏi tế bào vật chủ.

Hình 2. Chu kỳ sống của Sars CoV-2 (Song Z, 2019).

1.3. Sự thay đổi SARS-CoV-2 RNA, kháng nguyên và các kháng thể IgM và IgG trong bệnh COVID-19

Sự thay đổi mức độ RNA của SARS-CoV-2, kháng nguyên (antigen), các kháng thể IgM và IgG) của người trong quá trình nhiễm SARS-CoV-2 và quá trình hồi phục nói chung gồm 3 giai đoạn như sau:

1- Giai đoạn ủ bệnh (không triệu trứng): thường từ 0-5 ngày sau khi nhiễm SARS-CoV-2.

2- Giai đoạn khởi phát (xuất hiện triệu chứng): thường từ ngày thứ 5 sau khi nhiễm SARS-CoV-2.

3- Giai đoạn hồi phục (triệu chứng giảm dần): từ ngày thứ 14 sau khi nhiễm SARS-CoV-2 và khoảng ngày thứ 10 kể từ khi xuất hiện triệu chứng.

RNA và kháng nguyên của SARS-CoV-2 xuất hiện ngay từ ngày đầu bị nhiễm virus, đạt mức cao nhất vào khoảng ngày thứ 14 rồi giảm dần và có thể biến mất vào ngày thứ 21.

Kháng thể chống SARS-CoV-2 IgM thường xuất hiện vào ngày thứ 7 sau nhiễm virus, đạt mức cao nhất vào khoảng ngày thứ 14 đến 21 rồi giảm dần và có thể biến mất vào ngày thứ 28.

Kháng thể chống SARS-CoV-2 IgG thường xuất hiện muộn hơn, thường là vào ngày thứ 14 sau nhiễm virus, đạt mức cao nhất trong vòng vài tháng tiếp theo và có thể tồn tại một thời gian dài sau đó.

Sự hiểu biết về sự thay đổi mức độ RNA trong dịch hầu, họng, kháng nguyên và các kháng thể IgM và IgG trong máu, huyết thanh và huyết tương ở người nhiễm SARS-CoV-2 giúp người thầy thuốc chỉ định các xét nghiệm một cách chính xác và đánh giá được các giai đoạn trong tiến trình của bệnh COVID-19.

2. Chẩn đoán bằng xét nghiệm sinh học phân tử

2.1. Phản ứng polymerase sao chép ngược thời gian thực (rRT-CRP)

Xét nghiệm phân tử (molecular tests), thường sử dụng là phản ứng chuỗi polymerase sao chép ngược thời gian thực rRT-PCR (real-time reverse transcription polymerase chain reaction), giúp phát hiện virus ở người bị nhiễm được dựa trên việc phát hiện RNA của SARS-CoV-2 lấy từ dịch tiết mũi họng. PCR là một phương pháp được sử dụng để tạo ra một số lượng lớn các bản sao của các đoạn DNA ngắn từ một mẫu DNA rất nhỏ để có thể phát hiện ra nó. Quá trình này được gọi là quá trình khuếch đại DNA. Tuy nhiên, vì SARS CoV-2 là một loại virus có bộ gen là RNA và RNA là một phân tử axit nucleic đơn chuỗi, nên nó cần được tạo thành DNA bổ sung trước khi có thể được khuếch đại. Trong quá trình xét nghiệm, một enzym có tên reverse transcriptase gắn với RNA chuỗi đơn của virus và tạo ra một bản sao dựa trên DNA, sau đó DNA bổ sung này có thể được khuếch đại bằng quy trình PCR thông thường.

Xét nghiệm phân tử có khả năng giúp phát hiện những người bị nhiễm SARS-CoV-2, kết quả dương tính được xem là bị nhiễm virus này và có khả năng truyền bệnh, nếu kết quả âm tính là không bị nhiễm SARS-CoV-2 hoặc có thể đã khỏi bệnh. Xét nghiệm phân tử là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán SARS-CoV-2. Tuy nhiên, xét nghiệm này không cho biết một người có miễn dịch với nhiễm virus trong quá khứ hay chưa bị phơi nhiễm và vẫn còn nguy hiểm.

Các kết quả phân tích bộ gen của SARS-CoV-2 bằng rRT-PCR sử dụng các đoạn gen N1, N2, N3 và RNase P có thể được giải thích theo Bảng

Việc sử dụng chỉ 2 gen N1 và N2 của SARS-CoV-2 so với sử dụng 3 đoạn gen N1, N2, N3 và RNase P vẫn có sự phù hợp với tỷ lệ phần trăm dương tính là 100% (95% CI 88,7-100%) và với tỷ lệ phần âm tính là 100% (95% CI 88,7-100%) (Quest Diagnostics, 2020).

Một số gen khác của bộ gen của SARS-CoV-2 cũng có thể được sử dụng để phát hiện nhiễm SARS-CoV-2 nhờ rRT-PCR gồm các gen ORF1ab, RdRP, E,…

(Giải thích: Để nhận dạng các gen N1, N2, N3 và RNase P trong mẫu xét nghiệm đã khuếch đại, người ta phải chế sẵn ra các đoạn gen tương ứng trùng hợp với các gen trên theo cơ chế tương ứng di truyền gọi là đầu dò (probe). Đầu dò này có gắn các phân tử phát huỳnh quang. Nếu trong mẫu xét nghiệm có các gen N1, N2, N3 và RNase P thì các đầu dò sẽ bám chặt: phản ứng dương tính.)

2.2. Xét nghiệm kỹ thuật khuếch đại axit nucleic đẳng nhiệt (INAA)

Ngày 27/ 3/ 2020, FDA đã phê duyệt một xét nghiệm tự động từ Abbott Diagnostics Scarborough sử dụng kỹ thuật khuếch đại axit nucleic đẳng nhiệt (isothermal nucleic acid amplification technology). Ngày 13/ 4/ 2020, Bộ Y tế Canada đã phê duyệt một xét nghiệm tương tự từ Spartan Bioscience. Lợi ích của các xét nghiệm đẳng nhiệt này là có thể xét nghiệm bệnh nhân bằng máy phân tích DNA cầm tay và nhận kết quả mà không phải gửi mẫu đến các trung tâm xét nghiệm.

(Giài thích: Phương pháp này không cần ủ như phản ứng rRT-PCR trên, mà chỉ cần nhiệt độ của phòng thí nghiệm)

3. Xét nghiệm kháng thể chống SARS-CoV-2 IgM và IgG

Các xét nghiệm phát hiện miễn dịch dựa trên phát hiện định tính IgM và IgG được cơ thể tạo ra trong đáp ứng với nhiễm SARS-CoV-2. IgM là loại kháng thể xuất hiện sớm, trong khi IgG được tạo ra muộn hơn. IgM và IgG chống lại nhiễm virus bằng cách gắn vào các kháng nguyên đặc hiệu trên bề mặt của SARS-nCoV-2.

Xét nghiệm nhanh sắc ký miễn dịch (rapid immunochromatography test) được chế tạo để phát hiện định tính (qualitative) kháng thể đặc hiệu chống SARS-CoV-2. IgM và IgG có trong máu, huyết thanh hoặc huyết tương của người bị nhiễm SARS-CoV-2.

Vì thời gian ủ bệnh trung bình của nhiễm SARS-CoV-2 là khoảng 5,1 ngày, IgM đặc hiệu với SARS-CoV-2 có thể được phát hiện lần đầu trong khoảng thời gian từ 3 đến 5 ngày sau khi xuất hiện triệu chứng. Cũng vì vậy, chỉ nên sử dụng xét nghiệm kháng thể khi các triệu chứng xuất hiện ít nhất 3 ngày.

Ý nghĩa lâm sàng của các kết quả xét nghiệm nhanh đối với các kháng thể IgM, IgG và IgM+IgG để phát hiện SARS-CoV-2 được thể hiện:

Kết quả âm tính: chỉ có 1 vạch C (control: đối chứng): âm tính, không bị COVID-19 nếu rRT-PCR cũng (-) tính.

Kết quả dương tính với IgM: có 2 vạch C và M: IgM dương tính, bị COVID-19 nguyên phát giai đoạn sớm.

Kết quả dương tính, chỉ IgG: có 2 vạch C và G: IgG là dương tính và bị COVID-19 ở giai đoạn muộn (sau 28 ngày) hoặc tái phát.

Kết quả dương tính, IgG và IgM: có 3 vạch C, M và G: IgM và IgG dương tính: bị COVID-19 ở giai đoạn muộn (sau 14 – 28 ngày) (Davis CP, 2020).

Kết quả không xác định: tất cả các trường hợp không có vạch C, cần xem lại thuốc thử hoặc làm lại xét nghiệm với thuốc thử mới.

Tỷ lệ dương tính của IgG thường cao hơn IgM trong bệnh COVID-19 

Xét nghiệm kháng thể trong bệnh COVID-19 không xác nhận sự hiện diện của virus trong cơ thể, chúng chỉ cho biết bệnh nhân đang hoặc đã từng bị nhiễm với SARS-CoV-2. Do đó, xét nghiệm này chỉ nên được sử dụng để sàng lọc và nên được sử dụng cùng với với xét nghiệm phân tử để xác định tình trạng bệnh COVID-19 một cách toàn diện.

Ở những bệnh nhân không phát hiện được RNA từ dịch tiết mũi họng, sự có mặt trong huyết tương của các kháng thể chống SARS-CoV-2 cũng có giá trị chẩn đoán bệnh COVID-19 (Yuan Q, 2020). Các kết quả này cho thấy việc sử dụng kết hợp giữa các xét nghiệm RNA trong dịch mũi họng và xét nghiệm kháng thể trong máu là cần thiết, đặc biệt là đối với các bệnh nhân bị COVID-19 không phát hiện được RNA.

Về độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm kháng thể, theo tổng kết của Trường Đại học Johns Hopkins (Hoa Kỳ), tùy thuộc vào loại và thời điểm xét nghiệm, độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm chẩn đoán SARS-CoV-2 nhanh RDT (rapid diagnosis test) đối với IgM tương ứng là 97,2 và 100%, còn độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm IgG tương ứng là 87,9 và 100%; trong khi đó, độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) đối với IgM đều là 95%, còn độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm IgG tương ứng là 90 và 95%.

Sự kết hợp giữa xét nghiệm phân tử và kháng thể cho biết sự tiến triển qua các giai đoạn của bệnh COVID-19 một cách cụ thể hơn. Ý nghĩa lâm sàng của sự kết hợp các xét nghiệm phân tử và kháng thể trong đánh giá giai đoạn bệnh COVID-19 được thể hiện:

 

TT

rRT-PCR

IgM

IgG

Ý nghĩa lâm sàng

1

+

-

-

Bệnh nhân có thể ở thời kỳ cửa sổ của nhiễm, kháng thể chưa được sản xuất hoặc ở dưới ngưỡng phát hiện.

2

+

+

-

Bệnh nhân có thể ở giai đoạn sớm của nhiễm, bắt đầu đáp ứng miễn dịch với sự sản xuất kháng thể IgM.

3

+

+

+

Bệnh nhân có thể ở giai đoạn hoạt động của nhiễm, đáp ứng miễn dịch tiến triển với sự sản xuất của cả IgM và IgG.

4

+

-

+

Bệnh nhân ở giai đoạn muộn của nhiễm, IgM mất, IgG còn tồn tại hoặc rRT-PCR (+) tính có thể do tái phát.

5

-

+

-

Bệnh nhân có thể ở giai đoạn sớm của nhiễm. Kết quả rRT-CPR có thể là (-) tính giả hoặc IgM (+) tính giả.

6

-

-

+

Bệnh nhân có thể ở giai đoạn nhiễm đã qua và đã phục hồi.

7

-

+

+

Bệnh nhân có thể ở giai đoạn phục hồi của nhiễm hoặc kết quả rRT-CPR có thể là (-) tính giả.

4. Xét nghiệm kháng nguyên

Xét nghiệm phát hiện kháng nguyên mới của SARS-CoV-2 dựa trên nguyên tắc miễn dịch gắn enzym kháng thể kép (double antibody sandwich enzyme-linked immunoassay). Khay đọc vi giếng (microplate reader) được phủ trước một kháng thể kháng protein SARS-CoV-2. Khi huyết tương có chứa kháng nguyên protein N của SARS-CoV-2, nó sẽ gắn kháng thể đặc hiệu được phủ trên tấm vi giếng. Sau khi enzym horseradish peroxidase (HRP) dán nhãn gắn với kháng thể kháng protein N của SARS-CoV-2, một phức hợp "kháng thể gắn nhãn kháng nguyên-kháng thể-enzyme" (“antibody-antigen-enzyme labeled antibody" complex) được hình thành. Sau khi thêm chất nền 3,3' 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), enzym HRP sẽ xúc tác cho sự tạo màu. Các khay đọc vi giếng sẽ được đo giá trị hấp thụ để xác định sự có hay không kháng nguyên SARS-CoV-2 trong mỗi mẫu thử. Xét nghiệm kháng nguyên hiện chưa có các sản phẩm cho sử dụng lâm sàng.

(Hiện nay phương pháp này còn trong phòng thì nghiệm dành cho các nghiên cứu khoa học, chưa áp dụng bên ngoài, đọc để biết thôi!)

5. Các xét nghiệm khác

Ý nghĩa lâm sàng của các xét nghiệm bổ sung trong đánh giá mức độ nặng của bệnh COVID-19 được thể hiện:

 

TT

Các xét nghiệm

Thay đổi

Ý nghĩa lâm sàng

1

Tổng phân tích máu

Bạch cầu tăng,

BC trung tính tăng,

BC lympho tăng,

Tiểu cầu giảm

Nhiễm khuẩn

Nhiễm khuẩn

Giảm đáp ứng miễn dịch với virus

Rối loạn đông máu

2

Albumin

Giảm

Giảm chức năng gan

3

Lactate dehydrogenase (LDH)

Tăng

Tăng tổn thương phổi và/ hoặc tổn thương cơ quan lan rộng

4

Alanine aminotransferase (ALT)

Tăng

Tổn thương gan và/ hoặc tổn thương nội tạng trên diện rộng

5

Aspartate aminotransferase (ALT)

Tăng

Tăng tổn thương gan và/ hoặc tổn thương cơ quan lan rộng

6

Bilirubin toàn phần

Tăng

Tổn thương gan

7

Creatinine

Tăng

Tổn thương thận

8

Troponin tim

Tăng

Tổn thương tim

9

D-dimer

Tăng

Tăng kích hoạt đông máu và/ hoặc rối loạn đông máu lan tỏa

10

Thời gian Prothrombin (PT)

Tăng

Tăng kích hoạt đông máu và/ hoặc rối loạn đông máu lan tỏa

11

Procalcitonin

Tăng

Nhiễm vi khuẩn tăng

12

Protein phản ứng C (CRP)

Tăng

Nhiễm virus nặng/ nhiễm virus/ nhiễm khuẩn huyết do virus

13

Ferritin

Tăng

Viêm nặng

14

Cytokine (IL-6)

Tăng

Hội chứng bão Cytokine

Như vậy, ngoài các xét nghiệm chẩn đoán phân tử và kháng thể nêu trên, một số các xét nghiệm Hóa sinh và Huyết học cũng góp phần rất quan trọng trong việc đánh giá mức độ nặng, biến chứng, theo dõi hiệu quả điều trị và tiên lượng bệnh. Ngoài ra, các bằng chứng mới cho thấy rằng bệnh nhân mắc COVID-19 nặng có thể có nguy cơ bị hội chứng bão cytokine (cytokine storm syndrome). Các xét nghiệm cytokine, đặc biệt là IL-6, nên được sử dụng khi có điều kiện để đánh giá các bệnh nhân nặng nghi ngờ bị viêm quá mức (hyperinflammation).

Bs Nguyễn Nghiêm Luật