Nguyễn Thanh Tòng, Phạm Thị Thu Thủy, Hồ Tấn Đạt, Nguyễn Bảo Toàn, Nguyễn Bá Tòng, Nguyễn Thị Kiều Oanh, Đỗ Thị Thùy Trang.

Viêm gan do virus viêm gan C (HCV) là một bệnh nguy hiểm, khó điều trị, hậu quả bệnh nặng nề, chưa có thuốc chủng ngừa. Chính vì vậy, việc xác định,định lượng cũng như định được type của HCV là những thông số rất cần thiết cho các bác sĩ lâm sàng để lựa chọn phương án theo dõi và điều trị bệnh nhân. Chúng tôi thực hiện các kỹ thuật miễn dịch để tìm anti HCV,định serotype HCV, kỹ thuật sinh học phân tử để xác định HCVRNA bằng PCR, định lượng virus trong máu bằng Branched DNA. Kết quả cho thấy có70% trường hợp HCVRNA[+] trong 319 trường hợp anti HCV[+]; Serotype HCV trong 169 trường hợp chủ yếu là type 6: 44.38%, thứ hai là type 1:37.28%, với type 1 là type khó đáp ứng trong điều trị đặc hiệu. Kết quả định lượng cho thấy lượng virus cao và rất cao cũng chủ yếu thuộc trong 2 type trên. Qua kết quả trên chúng ta thấy vai trò các xét nghiệm sinh học phân tử trong chẩn đoán và điều trị viêm gan siêu vi C.

 

I. Đặt vấn đề:

Viêm gan do siêu vi C (HCV) là một bệnh nguy hiểm vì triệu chứng lâm sàng thường mơ hồ, trong khi đó hậu quả của bệnh để lại thường là nặng nề như: 50%-80% chuyển qua mạn tính, và có tới 20%-25% bệnh nhân mạn tính diễn tiến qua xơ gan và ung thư gan 3,6,8,9,11,15. Do đó, chẩn đoán chính xác tác nhân HCV là một mục tiêu quan tâm hàng đầu của các bác sĩ, từ đó mới điều trị, theo dõi diễn tiến và biến chứng của bệnh, phòng ngừa sự lây lan của HCV.

Ðể chẩn đoán viêm gan do siêu vi C, ngoài các xét ngiệm đánh giá chức năng gan, siêu âm... thì các xét nghiệm tìm HCV giữ một vai trò rất quan trọng. Bên cạnh xét nghiệm anti HCV, chúng tôi đã ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán thường qui để xét nghiệm trực tiếp tìm HCVRNA, một bằng chứng của nhiễm HCV &virus đang tăng sinh 6,8,9. Mặt khác, điều trị đặc hiệu HCV rất tốn kém,cho nên trước khi tiến hành điều trị ta nên đánh giá khả năng điều trị thành công cao hay thấp. Hai yếu tố giữ vai trò quan trọng trong tiên lượng đáp ứng điều trị là số lựơng virus và loại (type) virus 2,6,8,9.

Mục tiêu của nghiên cứu này là: (1) Khảo sát tỷ lệ HCVRNA ở bệnh nhân có anti HCV[+]; (2) Tìm hiểu mối tương quan giữa số lượng HCVRNA và type HCV; (3) Đánh giá khả năng phát triển của xét nghiệm để đáp ứng trong việc chẩn đoán và điều trị HCV.

II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:

1.Ðối tượng nghiên cứu:

Các bệnh nhân đã được chẩn đoán nhiễm HCV đến thực hiện HCVRNA tại MEDIC, từ tháng 10/1999-6/2000.

Các bệnh nhân viêm gan siêu vi C main tính , thực hiện định lượng &serotype HCV trước khi bắt đầu điều trị đặc hiệu từ tháng 10/2002 đếntháng 3 /2004.

2.Phương pháp nghiên cứu:

2.1 AntiHCV:

Kỹ thuật : miễn dịch gắn men trên vi hạt (MEIA: Microparticle EnzymeImmuno Assay).Test kit: AntiHCV, thế hệ 3 ,Abbott. Thực hiện trên máymiễn dịch tự động AXSYM, Abbott.

2.2 Định tính HCVRNA:

Kỹ thuật Heminested PCR: Khếch đại DNA đích. Ly trích RNA dựa theo quitrình Chomozynski. Ly trích RNA bằng Phenol – chroroform. Thực hiệnHeminested PCR trên máy Bio-Rad, theo chu kỳ nhiệt : 40 ­­ oC/10 min;94­­ oC/ 30 sec, 70­­ oC/30 sec, 20 chu kỳ; 94­­ oC/30 sec, 56­­ oC/30sec, 72­­ oC/2 min, 40 chu kỳ; 72­­ oC cho 10 min. PCR mix: EnzymReverse Transcriptase (Pharmacia), Enzym Taq polymerase (Pharmacia),dNTP (Pharmacia), Primer (Invitrogen), UNG (Pharmacia), MgCL 2, Mn CL 2.Điện di phân tích kết quả trên gel agarose, chụp hình bằng hệ thống GelDoc của Bio-Rad.

1.1 Ðịnh lượng HCV:

Kỹ thuật: Branched DNA: Khếch đại tín hiệu. Test kit: Bayer. Thế hệ 3. Thực hiện trên máy System 340 bDNA Analyzer, Bayer.

1.2 Serotype HCV:

Kỹ thuật: Phản ứng miễn dịch gắn men. Test kit: Murex. Thực hiện trên máy ELISA tự động ETI-STAR, Dia-Sorin.

1.3 Phương pháp nghiên cứu:

Tiền cứu cắt ngang.

III. Kết quả:

1. Thực hiện PCR phát hiện HCVRNA:

Tổng số 1023 trường hợp nhiễm HCV được thực hiện HCVRNA bằng PCR: Kết quả có728 (71%) trường hợp HCVRNA [+]; 295 (29%) trường hợp HCVRNA [-].

Có 319 trường hợp thực hiện đồng thời anti HCV (Thế hệ 3) và HCVRNA bằngPCR: Kết quả có 223 (70%) trường hợp HCVRNA [+]; 96 (30%) trường hợpHCVRNA [-].

2. Thực hiện serotype HCV:

Bảng 1

Type Số lượng

Tỉ lệ (%)

1

63

37.28%

2

18

10.65%

3

3

1.77%

6

75

44.38%

Không xác định

10

5.92%
Tổng cộng

169

100%

 

3. Khảo sát mối tương quan giữa số lượng HCV và HCV serotype:

Tổng cộng có 169 trường hợp.

Tuổi từ 21 – 71, độ tuổi trung bình là 47,4.

Giới: Nam 87 trường hợp (51.48%), nữ 82 trường hợp (48.52%).

Phân bố số lượng virus theo serotype.

Bảng 2

Type Số lượng copy

Tổng số (%)

< 10 5

10 5 – 10 6

10 6 – 2. 10 6

2. 10 6 – 10 7

> 10 7

1

8 (12.7)

5 (7.94)

8 (12.7)

31 (50.79)

10 (15.87)

63

2

1 (5.55)

3 (16.67)

4 (22.22)

10 (55.56)

  

18

3

      

1 (33.33)

2 (66.67)

3

6

11 (14.67)

12 (16)

10 (13.33)

32 (42.67)

10 (13.33)

75

Indetermine

  

1 (10)

  

7 (70)

2 (20)

10

 

Khảo sát số lượng virus theo nhóm type & tiên lượng đáp ứng với điều trị đặc hiệu. Bảng 3:

SEROTYPE

2x 10 6 copies/ml

>2x 10 6 copies/ml

 Tổng số

1

22 (34.92%)

41 (65.08%)

63

2

8 (44.44%)

10 (55.56%)

18

3

  

3 (100%)

3

6

33 (44%)

42 (56%)

75

Indetermine

1 (10%)

9 (90%)

10

 

IV. Bàn luận:

1. HCVRNA:

Chođến nay, xét nghiệm thường qui để chẩn đoán nhiễm HCV là anti HCV. Xétnghiệm này cũng được dùng trong tầm soát ở những người cho máu. Nhờ đóđã hạn chế rất nhiều tỷ lệ nhiễm HCV sau truyền máu. Tuy nhiên, trongmột số trường hợp như: Giai đoạn sớm của viêm gan siêu vi C, khi mà chưacó kháng thể; Ở bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch hay do dùng thuốc ứcchế miễn dịch; nồng độ anti HCV thấp... sẽ có tình trạng anti HCV âmtính giả. Mặc khác, khi mà bệnh nhân đã nhiễm trong quá khứ thì khángthể sẽ tồn tại một thời gian dài có khi đến 10 năm dù đã hết bệnh; đồngthời trong một số trường hợp như viêm gan tự miễn sẽ có Anti HCV dươngtính giả 6,7,8,11.

Chính vì vậy một khi áp dụng kỹ thuật PCR, mộtkỹ thuật cực kỳ nhạy & đặc hiệu để tìm HCVRNA là dùng đến một xétnghiệm trực tiếp tìm HCV, nhờ vậy xét nghiệm này tránh được một sốtrường hợp âm tính hoặc dương giả của Anti HCV 6,7.

Chúng tôi khảosát 2 nhóm bệnh nhân thực hiện Anti HCV : Một nhóm biết nhiễm HCV( Đãxét nghiệm Anti HCV ở ngoài, không rõ thế hệ test kit), một nhóm đượcthực hiện Anti HCV thế hệ III tại MEDIC. Bởi vì Anti HCV của thế hệ I,II có độ nhạy & đặc hiệu kém hơn . Kết quả cho thấy không có sự khácbiệt rõ rệt giữa 2 nhóm. Như vậy, có thể bệnh nhân đã được thực hiệnAnti HCV thế hệ III như tại trung tâm chúng tôi, hoặc đây là các bệnhnhân đã biết chắc nhiễm siêu vi C từ lâu .

Theo kết quả ở 2 nhómthực hiện HCVRNA, ta thấy chỉ có 71% & 70% trường hợp Anti HCV [+]là có mang HCVRNA, chứng minh là có mang virus dạng hoạt động. Cáctrường hợp anti HCV [+], HCVRNA [-] có thể do: bệnh nhân đã nhiễm và đãkhỏi bệnh, chỉ còn kháng thể tồn tại; HCVRNA rất dao động trong cơ thểnên phải làm lại HCVRNA sau 3 tháng để kiểm tra; Có thể là viêm gan tựmiễn và Anti HCV dương giả; HCVRNA âm tính giả do kỹ thuật thực hiệnPCR.

2. Serotype HCV:

Kết quả xác định type HCV như trìnhbày trong bảng 1. Chúng tôi áp dụng kỹ thuật miễn dịch để định type HCV.Ưu điểm của kỹ thuật này là đơn giản, có thể thực hiện ở máy hoàn toàntự động, rẻ, không sợ nguy cơ ngoại nhiễm. Sử dụng kháng nguyên của vùngNS 4 (Không cấu trúc) 1,16. Tuy nhiên, phương pháp này có một số nhượcđiểm như: Không định được subtype, chỉ xác định được kháng thể nên khôngrõ là bệnh nhân còn mang HCVRNA không, ở bệnh nhân bị ức chế miễn dịchhay suy giảm miễn dịch sẽ không có anti HCV và sẽ không xác định đượctype, không phân biệt được giữa anti HCV nhiễm trước đây còn tồn tại& type HCV đang nhiễm, một số dòng mới làm cho ta không xác địnhđược type... 2,3

Sự phù hợp giữa serotype và genotype vẫn cònnhiều bàn cãi do nhiều công trình công bố kết quả khác nhau 1. Theo tàiliệu cung cấp bởi hãng Murex, Murex HCV serotyping định type được84.7%(221/261) trường hợp, với 93.7%(207/221) trường hợp phù hợp vớigenotype 16. Theo Matinot & CS: thực hiện serotype HCV 220 trườnghợp có 8% không phù hợp với sequencing, độ đặc hiệu là 72%, độ nhạy 78%1. Tuveri & CS: Độ phù hợp giữa serotype và LiPA chỉ 12/21 ca(57%) ởbệnh nhân HIV[-], và 4/19 (21%) ca có HIV [+]. Nói chung, độ phù hợpgiữa serotype với kháng thể từ vùng NS4 và genotype HCV là 65-75%, và50-60% ở bệnh nhân bị ức chế miễn dịch 1.

Theo kết quả như trìnhbày trong bảng 1, các serotype chiếm tỷ lệ chủ yếu là type 1 và 6. Vớitype 1 là type khó đáp ứng với điều trị đặc hiệu, đồng thời cũng chiếmtỷ lệ cao trong các trường hợp tái phát 5,6,9,14 . Type 6 thường chỉ gặpở vùng Đông Nam Á 3,6 nên khả năng đáp ứng điều trị đặc hiệu chưa cónhiều nghiên cứu. Theo Nguyễn Thanh Hảo & CS, thực hiện trên 123 đốitượng cho máu tình nguyện, tỷ lệ genotype HCV type1: 1a: 15.4%, 1b:48.8%, 1: 5.6%; 6: 14.6% 4 ; Theo P. Trimoulet & CS thực hiệngenotype HCV trên 10 trường hợp: 1a: 10%, 1b : 40%, 6a: 50% 13 . Nhưvậy, kể cả genotype & serotype đều cho thấy type HCV chủ yếu ở ViệtNam là type 1 & 6. Tuy nhiên chúng ta cần có một nghiên cứu với sốlượng lớn hơn mới có thể khẳng định cho điều này. Trong thời gian tới,tại trung tâm chúng tôi sẽ tiến hành áp dụng 2 kỹ thuật : INNOLiPA vàSequencing trong việc định genotype HCV như một kỹ thuật thường qui. Khiđó, chúng ta sẽ có đủ dữ liệu để biết các type HCV của Việt Nam.

3. Số lượng virus HCV trong mỗi type khác nhau:

Sốlượng virus & type HCV là 2 yếu tố quan trọng trong việc tiên lượngđáp ứng với điều trị đặc hiệu. Type 1 thường khó đáp ứng với điều trịđặc hiệu.Theo bảng 2 và 3 ta thấy: Số lượng virus ở type 1 và 6 nhiều:Type 1 có 41 trường hợp (65.08%) trên 2x10 6 copies/ml; 10 trường hợp(15.87% ) trên 10 7 copies/ml. Type 6 có 42 trường hợp (56%) trên 2x10 6copies/ml; 10 trường hợp (13.33%) trên 10 7 copies/ml. Bên cạnh đó,type 2 có 10 trường hợp (55.56%) trên 2x10 6 copies/ml, tuy nhiên do chỉcó 18 trường hợp là type 2 nên khó có thể nói trong type 2 thì luợngvirus cao. Điều đặc biệt chúng tôi ghi nhận ở đây là không có trường hợpnào ở type 2 mà lượng virus cao hơn 10 7 copies/ml. Do đó nên thường ởtype 2 bệnh nhân đáp ứng cho điều trị đặc hiệu tốt hơn. Ngoài ra, ở 10trường hợp không xác định được type, lượng virus thường cao: 9 trườnghợp (90%) trên 2x10 6 copies/ml, trong đó có 2 trường hợp (20%) trên 10 7copies/ml. Như vậy các trường hợp không xác định này sẽ khó có đáp ứngtốt với điều trị đặc hiệu, để có thể xác định được type thì phải thựchiện thêm genotype. Đây chính là lý do chúng tôi tiến tới thực hiệnINNOLiPA & Sequencing cho định genotype HCV trong chẩn đoán thườngqui.

V. Kết luận:

Viêm gan do virus C vẫn còn khókhăn trong chẩn đoán, điều trị đắt tiền mà hiệu quả vẫn còn hạn chế,chưa có thuốc chủng ngừa. Tần suất mang HCVRNA của bệnh nhân anti HCV[+]là 70%. Như vậy các trường hợp anti HCV[+] mà không có HCVRNA chiếm 30%trường hợp. Hai serotype chủ yếu ở nhóm bệnh nhân chúng tôi là 1 &6; với type 1 có tiên lượng đáp ứng kém với điều trị. Do đó, cần cónghiên cứu với số lượng lớn hơn, áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử nhưLiPA, sequencing để xác định genotype, từ đó mới có lựa chọn điều trịđặc hiệu tốt nhất cho bệnh nhân nhiễm HCV. Kết quả thực hiện định lượngvirus trước& trong khi điều trị sẽ giúp ích rất nhiều cho chúng tatrong việc lựa chọn phương pháp điều trị, chọn thuốc, liều, thời điểmngưng điều trị.