Hồ Tấn Đạt, Phạm Thị Thu Thủy, Nguyễn Thanh Tòng, Nguyễn Bảo Toàn,Phan Hữu Bội Hoàn, Nguyễn Bá Tòng, Nguyễn Thị Kiều Oanh, Đỗ Thị ThùyTrang.
Trung Tâm Y Khoa MEDIC, TP Hồ Chí Minh.

Tóm tắt

 

Kiểu gen của siêu vi gây viêm gan C (HCV genotype) phân bố khác nhau tùy theo vùng địa dư, mỗi châu lục hay mỗi nước có những kiểu gen HCV vượt trội riêng. Chúng tôi ứng dụng kỹ thuật LiPA để xác định tần suất các kiểu gen HCV ở người Việt Nam bị viêm gan siệu vi C mãn tính. Ngoài ra, chúng tôi cũng tìm hiểu mối liên hệ giữa 2 yếu tố quan trọng trong việc tiên lượng đáp ứng điều trị đặc hiệu là kiểu gen HCV và định lượng siêu vi C bằng kỹ thuật Branched DNA. Trong thời gian từ tháng 4/2004 đến tháng 1/2005, tại phòng xét nghiệm Trung Tâm Y Khoa MEDIC, chúng tôi thực hiện LiPA cho 327 trường hợp. Trong đó, nam chiếm 57,5%, nữ chiếm 42,5% với tuổi trung bình là 47,90 ± 10,58. Chúng tôi xác định được 3 kiểu gen chính là 1, 6 và 2: kiểu gen HCV 1 chiếm 58,4%( 1: 5,8%; 1a:6,4%; 1a/1b: 0,3%; 1b: 45,9%), tiếp theo là kiểu gen 6( toàn bộ là 6a:23,9% ) và kiểu gen 2 là 13,1%(  2: 1,5%; 2a/2c: 11,6%). Chỉ có mộttrường hợp là kiểu gen 3b (0,3%). Có 14 trường hợp ( 4,3% ) không xác định được kiểu gen HCV bằng kỹ thuật LiPA,  chúng tôi tiếp tục thực hiện kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequencing) để xác định kiểu gen HCV (Hệ thống Trugene, Bayer) và  xác định được tất cả kiểu gen của 14 trường hợp đó: Kiểu gen 1 : 2 trường hợp; 1b: 2; 2a: 1; 2c: 1; 6a: 8. Có 229 trường hợp thực hiện định lượng siêu vi C trong máu. Lượng siêu vi dao động từ 3.200 bản sao/ml (Copies/ml) đến trên 40.000.000 bản sao/ml,trung bình 6,46x106 ± 8,50x106 bản sao/ml. Kiểu gen HCV 1, 2, 6 có lượng siêu vi C trên 2x106 bản sao/ml là 91, 18, 32 trường hợp; và có lượngsiêu vi C dưới 2x106 copies/ml là 46, 15, 27 trường hợp. Qua đó chúng tôi nhận thấy rằng không có sự khác nhau có ý nghĩa giữa lượng siêu vi C trong máu và kiểu gen 1, 2, 6 của siêu vi C ( p> 0,05).

Summary

PREVALENCE OF HCV GENOTYPES IN VIETNAM

Hepatitis C virus (HCV) genotypes are distributed differently depending ongeography and etiology of infection. We studied the spectrum of HCVgenotypes in Vietnamese patients. The incidence of Hepatitis C virusisolates was found in clinical practice is of great clinicalsignificance to the treatment of HCV infected patients as differentsubtypes may respond unequally to therapy. In our study, we performedthe LiPA to identify HCV genotype and to evaluate the prevalence of HCVgenotype in Vietnamese patients, and comparison of serum virus loadsamong patients infected with Hepatitis C Virus genotypes 1, 2 and 6. Atotal of 327 HCV RNA positive patients were enrolled (Male 57.5%, female42.5% with mean age of patients 47.90 ± 10.58 years
) from April2004 to January 2005. At the same time, we collected 229 random serumsin this group to perform Branched DNA for HCVRNA quantification. Thereceived results were genotypes 1 and 6 were the most common genotypes,followed by type 2 and the rare genotype 3 in alone patient. Genotype 1was seen in 58.4% (Type 1: 5.8%; 1a: 6.4%; 1a/1b: 0.3%; 1b: 45.9%) whilegenotype 6a in 23.9%, genotype 2 in 13.1% (Type 2: 1.5%; type 2a/2c:11.6%) and genotype 3b was in 0.3%, fourteen samples (4.3%) wereunclassified. Then we performed sequencing based on 5’UT with Trugenesystem identified genotype 1 (2 cases), 1b (2 cases), 2a (1 case), 2c (1case), 6a (8 cases) but not typed by LiPA. 229 patients had viral loadsabove 3,200 copies/ml (Range: 3,200 - > 40,000,000 copies/ml, with6,46x10­6 ±
8,50x10­6 copies/ml
). HCV genotype 1, 2, 6 whichhave quantity HCV RNA above 2x106 copies/ml were in 91, 18, 32 cases,and below 2x10­6 copies/ml were in 46, 15, 27 cases, respectively. Weobserved that there’s no significant difference in virus load betweenpatients infected with genotype 1, 2, 6 (P>0.05).

I. Đặt vấn đề:
Viêm gan do siêu vi C (HCV) là một bệnh nguy hiểm vì triệu chứng lâmsàng thường mơ hồ, trong khi đó hậu quả của bệnh để lại thường là nặngnề như: 50%-80% chuyển qua mạn tính, và có tới 20%-25% bệnh nhân mạntính diễn tiến qua xơ gan và ung thư gan 5,12,14,18,21,25,29. Do đó,chẩn đoán chính xác tác nhân HCV là một mục tiêu quan tâm hàng đầu củacác bác sĩ, từ đó mới điều trị, theo dõi diễn tiến và biến chứng củabệnh, phòng ngừa sự lây lan của HCV.
Cho đến nay, vấn đề điều trịđặc hiệu siêu vi gây viêm gan C vẫn còn nhiều khó khăn cũng như tốn kémvề mặt thời gian và tiền bạc. Đồng thời gần như chỉ có một lựa chọn duynhất của thuốc đặc trị là Interferon, mà tùy theo mỗi thế hệ của thuốcsẽ làm cho bệnh nhân phải gánh chịu thêm một số khó khăn trong dùngthuốc chích cũng như tác dụng phụ của thuốc1,6,18,19,21,27. Do đó, đốivới một bệnh nhân có chỉ định điều trị đặc hiệu cho siêu vi viêm gan Cthì trước khi bắt đầu điều trị phải làm xét nghiệm 2 yếu tố quan trọngcó vai trò tiên lượng cho thành công cũng như thời gian cần thiết củađiều trị là kiểu gen của siêu vi gây viêm gan C ( HCV genotype) và địnhlượng siêu vi trong máu5,11,14,25; Và một vài chỉ số khác như SGOT,SGPT, siêu âm, …
Kiểu gen HCV phân bố khác nhau tùy theo vùng địadư, mỗi châu lục hay mỗi nước có những kiểu gen HCV vượt trộiriêng4,5,7,8,10,12,15,27. Do đó, chúng tôi sử dụng kỹ thuật LiPA ( Làmột kỹ thuật sinh học phân tử) để xác định kiểu gen HCV ở người Việt Namvới mục đích phục vụ cho việc điều trị đặc hiệu cũng như khảo sát kiểugen nào của HCV chiếm chủ yếu ở người Việt Nam. Bên cạnh đó, chúng tôicũng ứng dụng kỹ thuật bDNA để định lượng HCV trong máu và thử tìm mốiliên hệ giữa kiểu gen của HCV và số lượng siêu vi C trong máu: Có haykhông sự khác nhau của số lượng siêu vi C giữa các kiểu gen khácnhau1,3,7,9.
Mục tiêu của nghiên cứu này là: (1) Xác định kiểu gencủa HCV ở người Việt Nam; (2) Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật LiPA trongviệc xác định kiểu gen HCV ở người Việt Nam; (3) Khảo sát mối liên hệgiữa kiểu gen HCV và số lượng siêu vi C trong máu.

II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:

1. Đối tượng nghiên cứu.
Các bệnh nhân Việt Nam đã được chẩn đoán nhiễm HCV đến thực hiện kiểugen HCV và định lượng HCV tại trung tâm y khoa MEDIC, từ tháng 04/2004đến 1/2005.
Có HCVRNA dương tính.

2. Phương pháp nghiên cứu.

2.1. Thực hiện LiPA.
Xác định HCVRNA: Kỹ thuật nested PCR (Khếch đại DNA đích bằng PCR tổ).Ly trích RNA dựa theo qui trình Chomozynski: Ly trích RNA bằng Phenol–chloroform. Thực hiện tổng hợp cDNA trên máy luân nhiệt của Bio-Rad,theo chương trình sau: 25­oC/5 phút, 42­­oC/30 phút, 85oC/5 phút, Sau đótiến hành phản ứng nested PCR trên máy luân nhiệt ( Bio-Rad), theo chukỳ nhiệt sau : 95­­oC/5 phút; 94­­oC/ 30 giây, 70­­oC/30 giây, 20 chukỳ; 94­­oC/30 giây, 55­­oC/30 giây, 72­­oC/ 1 phút, 40 chu kỳ; 72­­oCcho 10 phút; Sau đó giữ ở 4­oC. Chúng tôi sử dụng các hóa chất và thuốcthử sau đây để thực hiện RT và PCR: Enzym Reverse Transcriptase(Pharmacia), Enzym Taq polymerase (Pharmacia), dNTP (Pharmacia), PrimerNP & OP ( Trên vùng 5’UT của HCV, Bayer), MgCL2, MnCL2. Điện di phântích kết quả trên thạch agarose 2%, kích thước sản phẩm PCR dài 240 cặpbase (bp), chụp hình bằng hệ thống Gel Doc của Bio-Rad.
Thực hiệnquá trình lai các sản phẩm PCR đã có ( Với Primer NP & OP có gắnBiotin của Bayer) với các que (strip) của bộ thuốc thử LiPA . Trên cácque có các vạch gắn sẵn các đoạn dò (Probes) chuyên biệt cho từng kiểugen của HCV, sau khi lai sẽ đọc kết quả theo bảng hướng dẫn  được cungcấp bởi nhà sản xuất (Bayer).

2.2. Định lượng HCV.
Kỹ thuật:Branched DNA( Khếch đại tín hiệu). Thuốc thử dùng cho kỹ thuật là của Bayer, thế hệ 3. Thực hiện trên máy System 340 bDNA Analyzer, Bayer.

2.3. Men gan: SGOT, SGPT.
Kỹ thuật thực hiện theo phương pháp động học (Kinetic), đo ở bước sóngl=360 nm. Thuốc thử  của hãng Waco, Nhật. Thực hiện trên máy Hitachi747.

2.4. Phương pháp nghiên cứu:

Tiền cứu cắt ngang.

3. Thống kê: Phần mềm SPSS for Win, Ver. 7.5.

III. Kết quả:

1. Tổng số có 327 trường hợp thực hiện LiPA để xác định kiểu gen HCV.
Tuổi nhỏ nhất là 19, lớn nhất là 79 với độ tuổi trung bình là 47,90±10,58.
Nam có 188 trường hợp ( 57,5%) với độ tuổi trung bình là 47,22±11,35;nữ có 139 trường hợp ( 42,5%) với độ tuổi trung bình là 48,81±9,39.

2. Kiểu gen của HCV trong 327 trường hợp của bệnh nhân Việt Nam.
Bảng 1.

Kiểu gen HCV

1

1a

1a/1b

1b

2

2a/2c

3b

6a

Không định kiểu gen được

Tổng

Số lượng

19

21

1

150

5

38

1

78

14

327

Phần trăm

5,8%

6,4%

0,3%

45,9%

1,5%

11,6%

0,3%

23,9%

4,3%

100%

3. Khảo sát sự thay đổi men gan trong 327 trường hợp nhiễm HCV có HCVRNA(+).
Sự thay đổi của SGOT: Nhỏ nhất là 13, lớn nhất là 308 U/L, với giá trị trung bình là 53,95±45,56 U/L.
Sự thay đổi của SGPT: Nhỏ nhất là 10, lớn nhất là 390 U/L, với giá trị trung bình là 53,31±51,15 U/L.

Bảng 2.

 

Kiểu gen 1

Kiểu gen 2

Kiểu gen 3

Kiểu gen 6

Không định kiểu gen được

SGOT

61±52 U/L

42±34 U/L

121 U/L

45±32 U/L

36±18 U/L

SGPT

60±58 U/L

41±41 U/L

115 U/L

46±38 U/L

35±23 U/L

 

(còn tiếp)